@@ -10,15 +10,14 @@ A este grupo, a aquel otro ...
En general, este trabajo ha sido posible gracias a varias personas que han dedicado parte de su valioso tiempo a él, generalmente resolviendo las dudas que han ido surgiendo durante su realización, pero también prestando otro tipo de ayuda o recursos. Por ejemplo, el prof. Francisco Javier Santos Martin, miembro del Centro de Investigación Biomecánica y Ergonomía (CIBER), nos ha ayudado a comprender los procesos de calibración, especialmente en instrumentos de pesaje.
Asimismo, Paula Sáez Serrano y Vicente Yagüe Alcaraz, del Departamento de pesaje del Centro Español de Metrología (CEM), y a José Carlos Rodríguez Cabello y Matilde Alonso Rodrigo, del GIR BIOFORGE, han dedicado tiempo a responder algunas de nuestras dudas y a aportar comentarios respecto a la utilidad de este tipo de aplicaciones para el trabajo de investigación que realizan en su grupo y cómo emplean y calibran ellos sus instrumentos, especialmente micropipetas y balanzas.
Asimismo, Paula Sáez Serrano y Vicente Yagüe Alcaraz, del Departamento de pesaje del Centro Español de Metrología (CEM), y José Carlos Rodríguez Cabello y Matilde Alonso Rodrigo, del GIR BIOFORGE, han dedicado tiempo a responder algunas de nuestras dudas y a aportar comentarios respecto a la utilidad de este tipo de aplicaciones para el trabajo de investigación que realizan en su grupo y cómo emplean y calibran ellos sus instrumentos, especialmente micropipetas y balanzas.
Las pruebas de calibración de micropipetas y las fotografías de dicho proceso han podido realizarse gracias al apoyo de Rosario Gómez Gutiérrez, y Rodrigo García Loma, del Departamento de química analítica de la UVa, quienes nos han dado acceso a las balanzas calibradas de sus laboratorios, y a agua ultrapura Milli-Q.
Las pruebas de calibración de micropipetas y las fotografías de dicho proceso han podido realizarse gracias al apoyo de Rosario Gómez Gutiérrez, y Rodrigo García Loma, del Departamento de química analítica de la UVa, quienes nos han dado acceso a las balanzas calibradas de sus laboratorios y a agua ultrapura Milli-Q, y nos han proporcionado retroalimentación respecto a la aplicación y sus posibles mejoras.
Por otra parte, divesos miembros del GIR MIOMeT, como Alberto Diez de la Varga (...) por %servirnos de conejillos de indias y por las fotos.
prestaron la micropipeta, sus puntas, y los vasos de precipitado empleados en dichas pruebas de calibración. Las fotografías del soporte con micropipetas y la balanza se tomaron en sus laboratorios.
Por otra parte, divesos miembros del GIR MIOMeT, incluyendo a Alberto Diez de la Varga, Celedonio Álvarez, y Héctor Barbero San Juan también han prestado apoyo al proyecto prestándonos la micropipeta, las puntas, y los vasos de precipitado que se emplearon en la documentación de su proceso de calibración. Las fotografías del soporte con micropipetas y la balanza se tomaron en sus laboratorios.
El barómetro necesario para calcular la presión atmosférica fue prestado por Francisco Javier Carmona del Río, de Física Aplicada.
El barómetro necesario para calcular la presión atmosférica fue prestado por el prof. Francisco Javier Carmona del Río, de Física Aplicada.
Nuestro agradecimiento a Félix Antonio Santos González, quien nos (bases de datos UVa).
En el plano de recursos informáticos, quisiéramos expresar también nuestro aprecio a Félix Antonio Santos González, quien nos ha dado acceso a diversas bases de datos y otros recursos de la UVa, así como a los técnicos de la Escuela de Ingeniería Informática.
A todos ellos, nuestro más sincero agradecimiento.
@@ -300,17 +300,18 @@ Como se ha comentado anteriormente, las balanzas tienen un botón denominado ``a
\label{fig:MicropipetasMIOMeT}
\end{figure}
Una \textit{pipeta a pistón}, comúnmente llamada \textbf{micropipeta}, es un instrumento que permite aspirar y suministrar volúmenes precisos de un líquido, con capacidades que típicamente van entre un microlitro y algunos mililitros, dependiendo del modelo. Considerada por varios autores como el instrumento más ampliamente utilizado en biología y medicina~\cite{klingenberg_when_2005}, forma parte del grupo de aparatos volumétricos a pistón, que también incluye buretas, diluidores y dosificadores a pistón~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2010}. Este grupo de aparatos está cubierto por los estándares ISO 8655, dentro de los cuales, las partes 1, 6 y 7 contienen información general aplicable a todo el grupo. La primera (ISO 8655-1) se enfoca en terminología, requisitos y recomendaciones, mientras que las otras dos (ISO 8655-6 e ISO 8655-7), contienen métodos para ensayos de determinación del error de medida (o lo que es lo mismo, de calibración) mediante métodos gravimétricos y no gravimétricos, respectivamente. Por contra, la parte 2 (ISO 8655-2) está dedicada exclusivamente a este tipo de pipetas. El método de calibración más común es el descrito en la ISO 8655-6 (gravimétrico)~\cite{shirono_evaluation_2014}, que se discutirá en la subsección~\ref{ssec:concepto.micropipetas.calibracion}.
Una \textit{pipeta a pistón}, comúnmente llamada \textbf{micropipeta}, es un instrumento que permite aspirar y suministrar volúmenes precisos de un líquido, con capacidades que típicamente van entre un microlitro y algunos mililitros, dependiendo del modelo. Considerada por varios autores como el instrumento más ampliamente utilizado en biología y medicina~\cite{klingenberg_when_2005}, forma parte del grupo de aparatos volumétricos a pistón, que también incluye buretas, diluidores y dosificadores a pistón~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2010}. Este grupo de aparatos está cubierto por los estándares ISO 8655, dentro de los cuales, las partes 1, 6 y 7 contienen información general aplicable a todo el grupo. La primera (ISO 8655-1) se enfoca en terminología, requisitos y recomendaciones, mientras que las otras dos (ISO 8655-6 e ISO 8655-7), contienen métodos para ensayos de determinación del error de medida (o lo que es lo mismo, de calibración) mediante métodos gravimétricos y no gravimétricos, respectivamente. Por contra, la parte 2 (ISO 8655-2) está dedicada exclusivamente a este tipo de pipetas, mientras que el resto, las partes 3, 4, y 5, se centran en el resto de instrumentos del grupo mencionados anteriormente, las pipetas a pistón, diluidores y dosificadores, respectivamente. El método de calibración más común es el descrito en la ISO 8655-6 (gravimétrico)~\cite{shirono_evaluation_2014}, que se discutirá en la subsección~\ref{ssec:concepto.micropipetas.calibracion}.
%Definición, características, partes, modelos y variantes.
Dentro de este tipo de instrumento podemos encontrar diferentes variaciones. Dependiendo del si el usuario puede modificar el volumen que desea extraer o no, pueden clasificarse en micropipetas de volumen variable o de volumen fijo, respectivamente. Se llama \textbf{volumen nominal} al volumen más grande que puede seleccionar un usuario por cada canal, viene especificado por el fabricante, y corresponde al valor superior del rango del instrumento~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009, shirono_evaluation_2014}. En las pipetas multicanal sólo existe un mecanismo de ajuste de volumen para todos los canales, de modo que el volumen seleccionado en el mecanismo será el que tendrá cada canal.
Dentro de este tipo de instrumento podemos encontrar diferentes variaciones. Dependiendo del si el usuario puede modificar el volumen que desea extraer o no, pueden clasificarse en micropipetas de volumen variable o de volumen fijo, respectivamente. Al igual que en las pipetas de vidrio, las micropipetas tienen un rango de volúmenes que pueden extraer, y dentro de una misma serie de productos de cada fabricante, hay diferentes modelos con diversos rangos. Por otra parte, existen modelos que actúan como si fueran múltiples micropipetas fusionadas entre sí, lo que se denomina \textit{multicanal} (en contraposición a \textit{monocanal}). Por tanto una característica de este dispositivo es su \textbf{número de canales}. En las pipetas multicanal los mecanismos de selección de volumen (para aquellas que además sean de volumen variable) y de accionamiento (aspiración y expulsión del líquido) son comunes a todos los canales, de modo que el volumen seleccionado en el mecanismo por el usuario será el que tendrá para cada canal. A modo ilustrativo, en la figura \ref{fig:MicropipetasMIOMeT} se muestra un conjunto de micropipetas monocanal de volumen variable.
Por otra parte, existen modelos que actúan como si fueran múltiples micropipetas fusionadas entre sí, lo que se denomina \textit{multicanal} (en contraposición a \textit{monocanal}). Por tanto una característica de este dispositivo es su \textbf{número de canales}. En la figura \ref{fig:MicropipetasMIOMeT} se muestra un conjunto de micropipetas monocanal de volumen variable.
En cualquier tipo de micropipeta, se llama \textbf{volumen nominal} al volumen más grande que puede seleccionar un usuario por cada canal, viene especificado por el fabricante, y corresponde al valor superior del rango del instrumento~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009, shirono_evaluation_2014}. En micropipetas de volumen fijo, el volumen nominal es simplemente el valor del único volumen con el que trabajan.
este tipo de dispositivos pueden accionarse de forma manual o automática, y controlarse por medios mecánicos, electromecánicos o electrónicos~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009}.
Consta de diferentes partes, según puede apreciarse en la figura~\ref{fig:PartesMicropipeta}. Para operar una micropipeta, el usuario debe colocar una punta adecuada en el \textit{cono para puntas}, también llamado \textit{soporte para puntas}. Existen puntas de diferentes tamaños, asociados al rango admitido por la micropipeta, y algunas se diseñan para encajar en el cono de uno o varios fabricantes concretos, aunque existen puntas universales. Para facilitar la identificación del tamaño de punta a utilizar, normalmente se utiliza un código de colores, tiñendo el plástico de las puntas de azul (p. ej. para micropipetas de 100-1000 \textmu L), amarillo (p. ej. para las 2-200 \textmu L), o incoloras, y marcando alguna pieza en cada modelo de micropipeta del mismo color que las puntas que dicho modelo necesita.
este tipo de dispositivos pueden accionarse de forma manual o automática, y controlarse por medios mecánicos, electromecánicos o electrónicos~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009}.
Consta de diferentes partes, según puede apreciarse en la figura~\ref{fig:PartesMicropipeta} ... Para extraer una cantidad determinada de líquido, el usuario debe, en primer lugar, seleccionar aquella micropipeta dentro cuyo rango se encuentre el volumen deseado. Rangos típicos son ... . Para la selección, el usuario debe girar...~\cite{fuentes_lopez_manejo_2020}.
Para extraer una cantidad determinada de líquido, el usuario debe, en primer lugar, seleccionar aquella micropipeta dentro cuyo rango se encuentre el volumen deseado. Rangos típicos son ... . Para la selección, el usuario debe girar...~\cite{fuentes_lopez_manejo_2020}.
\begin{figure}[H]
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@@ -361,7 +362,6 @@ En mayo de 1968, Colin John Sanderson, de la Universidad de Queensland, Australi
Como se ha comentado anteriormente, tanto la norma ISO 8655-6~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009-1} como la ISO 8655-7 ~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009-2} describen procedimientos de calibración que se emplean como métodos de referencia. La primera describe métodos gravimétricos para pipetas, buretas, diluidores y dosificadores, y la segunda métodos no gravimétricos, en concreto el método fotométrico y el titrimétrico, para estos mismos instrumentos. Los métodos gravimétricos se basan en determinar el volumen de líquido extraído por el instrumento en base al peso del mismo mediante una balanza, mientras que los fotométricos [] y los titrimétricos [].
De entre estas dos, la ISO 8655-6 y la 8655-7 el más común es el definido en la primera. %TODO Mientras que los otras dos se recomienda reservarlos para ... (cuando no hay disponible una balanza)?
Por este motivo, en este apartado se presenta un resumen del mismo en las últimas ediciones disponibles en el año 2010, a modo ilustrativo. Debe tenerse en cuenta que versiones más modernas de estas normas pueden haber introducido cambios. Además del método descrito en la norma~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009-1, marin_perez_estimacion_2017}, los manuales de las micropipetas de diversos fabricantes pueden incluir métodos de calibración simplificados basados en el primero~\cite{sartorius_biohit_liquid_handling_oy_proline_2013, albrecht_vwr_2012}.
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@@ -454,9 +454,12 @@ Una vez se cuenta con dicho material, debe procederse de la siguiente manera:
Tras haber ejecutado los pasos anteriores para los tres volúmenes de prueba, y como resultado haber obtenido los datos necesarios, se puede proceder a la \textbf{evaluación de los resultados}. En primer lugar, debe calcularse la pérdida de masa debida a la evaporación para cada repetición. $\frac{m_{10}-m_{11}}{10}$
En segundo lugar, si en los pasos \ref{pasosCalMicropipetas.TaradoCiclico} y \ref{pasosCalMicropipetas.AnotadoMasa} se optó por no tarar la balanza en cada repetición, debe calcularse la masa depositada en el recipiente de pesaje en cada una de dichas repeticiones calculando $m_{j, i}= m_{1, j, i}- m_{0, j, i}$ .
A continuación, si en los pasos \ref{pasosCalMicropipetas.TaradoCiclico} y \ref{pasosCalMicropipetas.AnotadoMasa} se optó por no tarar la balanza en cada repetición, debe calcularse la masa depositada en el recipiente de pesaje en cada una de dichas repeticiones calculando
\begin{equation}
m_{j, i} = m_{1, j, i} - m_{0, j, i}
\end{equation}
En tercer lugar, debe convertirse la masa de cada repetición corregida $m_i$ a su volumen, $V_i$. Para ello, debe multiplicarse por un factor de corrección que tiene en cuenta la densidad del agua (recordemos que la densidad de un material es directamente proporcional a su masa e inversamente a su volumen, pero también es dependiente de la temperatura)
En cualquiera de los dos casos, se haya tarado durante el procedimiento o no, ahora se dispone de las masas individuales depositadas en cada repetición $m_i$, y deben a ser convertidas a su volumen, $V_i$. Para ello, debe multiplicarse por un factor de corrección que tiene en cuenta la densidad del agua (recordemos que la densidad de un material es directamente proporcional a su masa e inversamente a su volumen, pero también es dependiente de la temperatura)
Una vez obtenidos el error sistemático $e_i$ y el aleatorio, debemos . En la figura~\ref{fig:HojaCaracteristicasBiohitProline} se muestra un fragmento del manual de usuario para las micropipetas monocanal de volumen variable de la serie Proline, de la empresa Biohit.
Una vez obtenidos el error sistemático $e_i$ y el aleatorio, debemos compararlos con unos valores de referencia para saber si se encuentran dentro del rango considerado aceptable. Dichos rangos de referencia, cuyos valores extremos se conocen como \textbf{errores máximos permitidos}~\cite{bipm_vocabulario_2014}, pueden ser los proporcionados por la ISO 8655-2~\cite{international_organization_for_standardization_piston-operated_2009}, por el manual de usuario del fabricante de la micropipeta, o uno definido por el usuario, de acuerdo a las necesidades del laboratorio. A modo ilustrativo, en la figura~\ref{fig:HojaCaracteristicasBiohitProline} se muestra un fragmento del manual de usuario para las micropipetas monocanal de volumen variable de la serie Proline, de la empresa Biohit, en el que se detallan los errores máximos permitidos de cada modelo, y, para cada uno de éstos, los de los tres volúmenes de prueba.
\begin{figure}
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@@ -534,7 +537,7 @@ Una vez obtenidos el error sistemático $e_i$ y el aleatorio, debemos . En la fi
El ajuste de una micropipeta se realiza normalmente con la ayuda de una herramienta llamada \textbf{llave de calibración}.
El ajuste de una micropipeta se realiza normalmente con la ayuda de una herramienta llamada \textbf{llave de calibración}, aunque una vez más estamos ante un abuso del lenguaje. Típicamente, dichas llaves contienen alguna sección que encaja en una ranura ubicada en el cuerpo de la pipeta. Al girar dicha llave a izquierda o a derecha, el
Algunas empresas que comercializan piezas como repuestos y llaves de ajuste tienen disponibles en sus páginas web algunas guías de calibración~\cite{pipette_supplies_inc_how_2021}. No existe una llave universal para hacer el ajuste, sino que cada serie puede llegar a tener una llave específica, aunque dos o más series del mismo fabricante, o incluso series de diferentes fabricantes, pueden compartir el mismo tipo de llave. A modo de ejemplo, en la figura~\ref{fig:LlavesAjusteMicropipetas} se muestran dos modelos de micropipetas junto con sus correspondientes llaves de ajuste a la derecha de cada una. La micropipeta de la izquierda tiene un rango útil de [] a [] \textmu L y pertenece a la serie Signature\textsuperscript{TM} Ergonomic High Performance (EHP), de la casa VWR, que son prácticamente iguales a las de la serie BioPette\textsuperscript{TM} Plus de la casa Labnet. La de la derecha permite medir de [] a [] \textmu L y es de la serie Proline del fabricante Biohit\textsuperscript{TM} (ahora parte de Sartorius AG).
